Sắc ký là một trong những phương pháp tách các chất. Nó được sử dụng để phân tích định tính và định lượng tiếp theo về các đặc tính vật lý và hóa học của vi hạt. Một biến thể của công nghệ này là sắc ký ái lực. Ý tưởng phân biệt các hợp chất protein bằng cách sử dụng đặc tính của ái lực phân tử đã được biết đến trong khoa học trong vài thập kỷ. Tuy nhiên, nó chỉ được phát triển trong những năm gần đây, sau khi ra đời các vật liệu ưa nước có độ xốp cao được sử dụng làm ma trận. Phương pháp này cho phép giải cả các bài toán phân tích (tách các chất và xác định chúng) và các bài toán điều chế (tinh chế, cô đặc).
Cốt
Sắc ký ái lực (từ tiếng Latinh affinis - “gần kề”, “liên quan”) dựa trên tương tác ái lực, là sự hình thành các liên kết đặc hiệu cao giữa phân tử đệm (phối tử hoặc liên kết) và phân tử đích. Những cơ chế này phổ biến rộng rãi trong tự nhiên (kết nối của chất trung gian hoặc hormone và thụ thể, kháng thể vàkháng nguyên, lai các polynucleotide và các loại quy trình khác). Trong y học, sắc ký ái lực đã được sử dụng cho các mục đích thực tế từ năm 1951
Các thành phần được phân tách như sau:
- dung dịch làm việc có chứa chất cần phân lập được đưa qua chất hấp thụ;
- phối tử lắng đọng trên ma trận chất hấp thụ giữ lại chất này;
- nó tập trung (tích tụ);
- chiết xuất chất cô lập từ chất hấp thụ bằng cách rửa bằng dung môi.
Phương pháp này cho phép bạn tách toàn bộ tế bào. Sự khác biệt so với sắc ký hấp phụ truyền thống là có sự liên kết đặc hiệu sinh học mạnh mẽ của thành phần cô lập với chất hấp thụ, được đặc trưng bởi tính chọn lọc cao.
Chất hấp phụ
Các chất sau được dùng làm chất hấp phụ:
- Hợp chất gel dựa trên agarose, một polysaccharide thu được từ thạch. Thông dụng nhất là 3 giống: sepharose 4B, CL (agarose liên kết chéo) và affi-gel. Chế phẩm thứ hai là một gel biến tính của agarose và polyacrylamide. Nó có tính trơ sinh học cao hơn, khả năng chống hóa chất và nhiệt cao.
- Silica (silica gel).
- Kính.
- Polyme hữu cơ.
Để loại bỏ các trở ngại cơ học trong quá trình tiếp xúc với phối tử, các chất bổ sung được sử dụng để tách nó khỏi chất mang (peptit, diamines, polyamines, oligosaccharides).
Thiết bị
Thiết bị sắc ký ái lực bao gồm các đơn vị chính sau:
- bể chứa cho pha động (chất rửa giải);
- máy bơm áp suất cao để cung cấp trung bình (thường xuyên nhất là pittông);
- lọc để làm sạch chất rửa giải khỏi bụi;
- thiết bị định lượng;
- cột sắc ký để tách hỗn hợp;
- dò để phát hiện các thành phần tách rời khỏi cột;
- máy ghi sắc ký và bộ vi xử lý (máy tính).
Để giảm lượng không khí hòa tan, heli trước tiên được đưa qua pha động. Để thay đổi nồng độ của chất rửa giải, một số máy bơm do bộ lập trình điều khiển được lắp đặt. Cột sắc ký được làm bằng thép không gỉ (để tăng yêu cầu chống ăn mòn), thủy tinh (tùy chọn phổ biến) hoặc acrylic. Đối với mục đích chuẩn bị, đường kính của chúng có thể thay đổi từ 2 đến 70 cm. Trong sắc ký phân tích, các vi cột Ø10-150 µm được sử dụng.
Để tăng độ nhạy của máy dò, thuốc thử được đưa vào hỗn hợp, góp phần hình thành các chất hấp thụ nhiều tia hơn trong vùng tử ngoại hoặc vùng khả kiến của quang phổ.
Phương pháp
Có 2 loại sắc ký ái lực lỏng chính:
- Cột, trong đó cột được lấp đầy bởi pha tĩnh và hỗn hợp được dẫn qua nó với dòng chảychất rửa giải. Sự phân tách có thể xảy ra dưới áp suất hoặc trọng lực.
- Lớp mỏng. Chất rửa giải di chuyển dọc theo lớp chất hấp phụ phẳng dưới tác dụng của lực mao dẫn. Chất hấp phụ được áp dụng cho một đĩa thủy tinh, thanh sứ hoặc thạch anh, lá kim loại.
Các giai đoạn chính của công việc bao gồm:
- chuẩn bị chất hấp phụ, cố định phối tử trên chất mang;
- cấp hỗn hợp tách vào cột sắc ký;
- tải pha động, liên kết thành phần bằng phối tử;
- thay thế pha để cô lập chất liên kết.
Điểm đến
Sắc ký ái lực dùng để phân lập các loại chất sau (loại phối tử được sử dụng ghi trong ngoặc):
- chất tương tự của chất ức chế enzym, chất nền và chất đồng yếu tố (enzym);
- chất hữu cơ sinh học có dấu hiệu khác biệt về gen, vi rút và tế bào (kháng thể);
- carbohydrate trọng lượng phân tử cao, polyme monosaccharide, glycoprotein (lectin);
- protein hạt nhân, nucleotidyltransferase (axit nucleic);
- thụ thể, protein vận chuyển (vitamin, hormone);
- protein tương tác với màng tế bào (tế bào).
Công nghệ này cũng được sử dụng để thu được các enzym cố định và liên kết chúng với xenluloza cho phép sản xuất các chất hấp thụ miễn dịch.
Sắc ký của các protein liên kết DNA
Việc phân lập các protein liên kết DNA được thực hiện bằng cách sử dụngheparin. Glycosaminoglycan này có khả năng liên kết nhiều loại phân tử. Sắc ký ái lực của các protein thuộc nhóm này được sử dụng để phân lập các chất như:
- yếu tố bắt đầu và kéo dài quá trình dịch mã (tổng hợp các phân tử axit nucleic và protein);
- limitedases (các enzym nhận biết các trình tự nhất định trong DNA sợi đôi);
- DNA ligases và polymerase (enzyme xúc tác sự liên kết của hai phân tử để tạo thành liên kết hóa học mới và tham gia vào quá trình sao chép DNA);
- chất ức chế protease serine đóng một vai trò quan trọng trong quá trình miễn dịch và viêm;
- yếu tố tăng trưởng: nguyên bào sợi, Schwann, nội mô;
- protein của chất nền ngoại bào;
- thụ thể hormone;
- lipoprotein.
Nhân phẩm
Phương pháp này là một trong những phương pháp cụ thể nhất để phân lập các hợp chất phản ứng (enzym và các tập hợp lớn hơn - vi rút). Tuy nhiên, nó không chỉ được sử dụng để phân lập các hoạt chất sinh học.
Phát hiện kháng thể với số lượng nhỏ, đánh giá định lượng axit polyadenylic, xác định nhanh khối lượng phân tử của dehydrogenaza, loại bỏ một số chất ô nhiễm, nghiên cứu động học của sự hoạt hóa dạng trypsin không hoạt động, cấu trúc phân tử của con người interferon - đây không phải là toàn bộ danh sách các nghiên cứu sử dụng ái lực. sắc ký. Việc sử dụng tại phòng khám là do những ưu điểm của nó như:
- Khả năng làm sạch hiệu quảprotein, polisaccarit, axit nucleic. Chúng hơi khác nhau về đặc tính vật lý và hóa học và mất hoạt tính trong quá trình thủy phân, biến tính và các loại xử lý khác được sử dụng trong các phương pháp khác.
- Tốc độ phân tách các chất, bản chất động học của quá trình.
- Không cần tinh chế enzyme đặc biệt và đồng nhất isoenzyme để xác định hằng số phân ly.
- Có khả năng phân tách nhiều loại chất.
- Tiêu thụ ít phối tử.
- Khả năng tách các chất với khối lượng lớn.
- Quá trình đảo ngược liên kết các đại phân tử sinh học.
Kỹ thuật này có thể được kết hợp với các kỹ thuật khác, để tạo ra một trường bổ sung (hấp dẫn, điện từ). Điều này cho phép bạn mở rộng khả năng kỹ thuật của sắc ký.
Kỹ thuật enzyme
Nhờ phương pháp này, sự phát triển tích cực của một nhánh công nghệ sinh học mới - kỹ thuật enzyme đã bắt đầu.
Sắc ký ái lực để phân lập enzyme có những ưu điểm sau:
- thu được enzyme với số lượng lớn nhờ ít thời gian hơn - giảm giá thành;
- cố định enzym có thể mở rộng đáng kể phạm vi ứng dụng của chúng trong y học và công nghiệp;
- Sự liên kết của các enzym với chất hỗ trợ rắn không hòa tan làm cho nó có thể nghiên cứu ảnh hưởng của vi môi trường và hướng của các phản ứng, đóng một vai trò quan trọng trong các quá trình tự nhiên và sinh lý.
