PCR, hay phản ứng chuỗi polymerase, là một kỹ thuật phòng thí nghiệm phức tạp được sử dụng rộng rãi trong y học và các lĩnh vực khoa học khác. Chẩn đoán PCR đã có lúc trở thành một bước đột phá thực sự trong khoa học.
Mô tả
PCR định lượng là một loại PCR thời gian thực.
Đây được hiểu là một biến thể của PCR, trong đó động học của phản ứng được ghi lại liên tục, giúp có thể đánh giá định tính hàm lượng của các trình tự nucleotide DNA cụ thể trong một hỗn hợp phân tử phức tạp.
Phương pháp PCR định lượng sẽ được thảo luận chi tiết hơn bên dưới.
Bản chất của phân tích
Phương pháp văn hóa và huyết thanh học đặc biệt thường được sử dụng để chẩn đoán nhiễm trùng. Theo cách thứ nhất, các kháng thể đối với mầm bệnh truyền nhiễm trong huyết thanh được xác định. Trong cách thứ hai, vật liệu sinh học lấy từ người bệnh được sử dụng để gieo vào một môi trường cụ thể thuận lợi cho sự phát triển của các khuẩn lạc mầm bệnh. Chẩn đoán ở cả haitrường hợp có thể kéo dài vài ngày hoặc vài tuần.
Kiểm tra PCR có thể được thực hiện với các vật liệu sinh học khác nhau được lấy từ người bệnh. Máu và các phương tiện và chất lỏng bệnh lý, sinh lý và sinh học khác đóng vai trò là mẫu. Bạn có thể làm PCR phân hoặc nước tiểu.
Các bệnh nhiễm trùng không điển hình và virus thường được chẩn đoán bằng PCR định lượng, vì chúng có thể không dễ chẩn đoán do bản chất cụ thể của quá trình bệnh lý do chúng gây ra. Để xác định các bệnh nhiễm trùng như vậy, cần có thời gian, trong đó các kháng thể bắt đầu được sản xuất trong cơ thể, được xác định bằng các phương pháp huyết thanh học. Nhưng điều này là không thể chấp nhận được trong một số trường hợp.
Phương pháp thực hiện
Phương pháp PCR - phòng thí nghiệm phát hiện nhiễm trùng trong các mẫu được phân lập từ bệnh nhân (trong ống nghiệm).
Để tiến hành phản ứng chuỗi polymerase, cần phải có một bộ thuốc thử đặc biệt.
Vật liệu thử được cho thuốc thử vào ống nghiệm. Các ống nghiệm được đặt trong một thiết bị đặc biệt - bộ khuếch đại PCR, được thiết kế để khuếch đại (tăng số lượng) các đoạn RNA hoặc DNA mong muốn, bộ khuếch đại PCR hoạt động theo chế độ tuần hoàn. Trong bất kỳ chu kỳ nào, nếu các mẫu chứa trình tự RNA hoặc DNA của mầm bệnh, thì ngày càng nhiều bản sao của các phần tử của các axit nucleic này tích tụ trong dung dịch. Bạn có thể xác định sự hiện diện của mầm bệnh và số lượng của nó trong các mẫu.
Các loại PCR
Phân tích định tính bằng PCR cho phép bạn nhận được kết quả sau:
- âm tính khi không tìm thấy mầm bệnh quan tâm trong các mẫu thử;
- dương tính nếu các trình tự được tìm thấy trong các mẫu đặc trưng cho một mầm bệnh cụ thể.
Với kết quả PCR dương tính, chúng tôi có thể nói với độ chính xác 95% về sự hiện diện của bệnh nhiễm trùng được chẩn đoán. Đồng thời, độ chính xác của bộ PCR được sử dụng cho mục đích chẩn đoán đạt 100%.
Thông thường 5% kết quả không chính xác do yếu tố con người quyết định. Ví dụ: vi phạm kỹ thuật phân tích và bảo quản thuốc thử có thể làm giảm đáng kể độ chính xác của nghiên cứu.
PCR định lượng xác định khái niệm tải lượng vi rút. Có thể xác định có bao nhiêu bộ DNA mầm bệnh trong các mẫu lấy từ bệnh nhân.
Mức độ nghiêm trọng của nhiễm trùng tỷ lệ thuận với sự gia tăng số lượng của chúng. Bạn cũng có thể xác định sự thành công của liệu pháp giảm tải lượng vi rút.
Đệ trình cho vật liệu sinh học PCR
Định lượng PCR được thực hiện tại phòng khám, chủ yếu vào buổi sáng. Trong quá trình thăm khám, bệnh nhân sẽ được hướng dẫn những gì cần lấy: nạo, chọc, nước tiểu hoặc máu. PCR có thể phát hiện mầm bệnh bất kể mức độ ô nhiễm của vật liệu.
Để phân tích dương tính, về lý thuyết, chỉ cần có một mầm bệnh trong mẫu. Trong thực tế, họ cố gắng tạo điều kiện thuận lợi hơn nữa. Có một số khuyến nghị cho việc này:
- nếu họ lấy một cái cạo hoặc miếng gạc từ bộ phận sinh dụcnội tạng, bạn cần hạn chế giao hợp thân mật ba ngày trước khi nghiên cứu;
- bạn không thể thụt rửa bằng thuốc kháng khuẩn hoặc tắm rửa trước khi phân tích;
- ba giờ trước khi lấy dịch soi niệu đạo, bạn cần phải kiên nhẫn và không được làm sạch ruột.
Đừng tuân theo những quy tắc này khi hiến máu.
Kết quả phân tích PCR định lượng được diễn giải như thế nào?
Đánh giá định lượng kết quả thu được
Trong một số tình huống lâm sàng, vấn đề về hiệu quả của việc điều trị và / hoặc động lực của quá trình bệnh lý xuất hiện. Những câu hỏi như vậy đặc biệt có liên quan khi kiểm tra những người bị nhiễm trùng mãn tính (vi rút suy giảm miễn dịch ở người, viêm gan B và C). Khi chẩn đoán, họ dựa trên thực tế là sự tích tụ của amplicon (sản phẩm PCR) tỷ lệ thuận với sự hiện diện của các bản sao của gen mong muốn trong mẫu được phân tích.
Tất nhiên, việc tính đến kết quả của PCR định lượng được thực hiện bằng phương pháp điện di trên gel với việc nghiên cứu cường độ của các tín hiệu PCR đặc biệt. Ngoài ra, điều kiện tiên quyết để đánh giá định lượng chính xác các kết quả thu được là các mẫu đối chứng dương tính đáng tin cậy có chứa một số lượng bản sao đã biết của gen mong muốn (ví dụ, một nghìn bản sao của gen viêm gan C cho một phản ứng PCR). Một số độ pha loãng nối tiếp của kiểm soát định lượng cho phép tạo ra các đường chuẩn và được sử dụng để đánh giá hàm lượng của các ống gen lâm sàng trong các mẫu bệnh phẩm.
Trong định nghĩa về PCR định lượng, một thành tựu quan trọng là tạo rađầu dò DNA huỳnh quang được thêm vào hỗn hợp phản ứng đồng thời với các mồi đơn giản và cho phép bạn theo dõi quá trình PCR kịp thời, tức là PCR thời gian thực.
Phương pháp TaqMan đề cập đến việc tổng hợp các đầu dò DNA huỳnh quang đặc trưng cho phần giữa của amplicon và có hai nhãn ở đầu. Một trong số chúng là nhãn huỳnh quang, nhãn thứ hai là phân tử dập tắt cho huỳnh quang này.
Một thiết bị đặc biệt, là sự kết hợp giữa máy đo độ huỳnh quang và bộ khuếch đại khối nhiệt, thực hiện các phép đo huỳnh quang liên tục trong mỗi ống nghiệm (nguyên tắc PCR thời gian thực). Sau 20-40 chu kỳ PCR, sẽ thu được các đường cong riêng lẻ cho từng mẫu. Số lượng bản sao của gen mong muốn có trong mẫu thử nghiệm có thể được tính toán từ các đường chuẩn với mẫu đối chứng.
Ngoài ra, một đặc điểm quan trọng của việc thực hiện PCR bằng phương pháp huỳnh quang là không cần mở ống có hỗn hợp PCR khi tính đến kết quả. Điều này làm giảm khả năng phòng bị nhiễm các sản phẩm khuếch đại và không cần phân bổ các khu vực làm việc đặc biệt cho điện di.
Bảng điểm PCR định lượng cho thấy điều gì?
Điều gì đang được khám phá?
Thông qua một phương pháp như PCR định lượng, những thay đổi về chất trong gen được tìm thấy: chèn, mất đoạn và đột biến điểm. Nhưng với một số rối loạn di truyền, các triệu chứng tương ứng xuất hiện để phản ứng với sự thay đổi nội dung của một số gen nhất định.
Cảm ơnPhân tích định lượng cho kết quả bằng số, thường tính bằng IU / ml. Điều này có nghĩa là trong một mililit mẫu thử nghiệm, một số lượng bản sao nhất định của RNA hoặc DNA của mầm bệnh, được đo bằng đơn vị quốc tế, đã được tìm thấy.
Tùy theo mức độ mà chẩn đoán mức độ nghiêm trọng của nhiễm trùng. Máu thường được xét nghiệm để xác định tải lượng vi-rút, vì vi-rút di chuyển tự do trong máu khi bị bệnh.
Tính năng
Định lượng PCR trong xét nghiệm máu có hai tính năng.
- Việc phân tích được thực hiện với sự có mặt của mồi hoặc deoxyribonucleoside triphosphat, được dán nhãn huỳnh quang hoặc phóng xạ để xác định chính xác hàm lượng của sản phẩm PCR được tạo thành.
- Trong quá trình PCR, hãy kết thúc phản ứng sớm trước khi xuất hiện quá nhiều sản phẩm PCR. Điều này là do thực tế là ở giai đoạn cuối của quá trình bão hòa, khi có nhiều sản phẩm PCR, cả bản thân enzyme và cơ chất đóng vai trò là các liên kết giới hạn của phản ứng này. Sự kết thúc của chu kỳ PCR tiếp theo trong những điều kiện như vậy không còn được đặc trưng bởi số lượng sản phẩm PCR tăng gấp đôi, sự khác biệt về số lượng không đáng kể giữa các mẫu khác nhau được san bằng, được xác định khá rõ ràng trong giai đoạn đầu sau khi trải qua một loạt các chu kỳ phản ứng.
Chi phí chẩn đoán PCR
Nghiên cứu PCR có chi phí, tùy thuộc vào loại nhiễm trùng sẽ được xét nghiệm, vào phương pháp phân tích và vật liệu xét nghiệm. Để xác định một bệnh nhiễm trùng, bạn sẽ phải cung cấp cho200-800 rúp. Phí lấy vật liệu sinh học cũng được tính thêm - khoảng 400 rúp.
